XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI SINH VẬT
Giới thiệu
Phép thử sau đây cho phép xác định số lượng khuẩn ưa nhiệt trung bình và nấm có thể phát triển được trong điều kiện hiếu khí,
Phép thử nhằm đánh giá chế phẩm thử có đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng đã công bố về chi tiêu vi sinh hay không. Khi sử dụng phép thử cho mục đích này, cần tuân thủ theo chỉ dẫn dưới đây về số lượng mẫu đem thử, đánh giá kết quả.
Phép thử nàỵ không áp dụng được đối với chế phẩm thuốc có thành phần chính là vi sinh vật sống.
Có thể sử dụng qui trình kiểm tra vi sinh khác, bao gồm các phương pháp tự động nếu chứng minh được tính tương đương của chúng với phương pháp ghi trong dược điển.
Qui định chung
Tiến hành phép thử trong điều kiện đảm bảo tránh được sự tạp nhiễm vi sinh vật bên ngoài vào mẫu thử. Các biện pháp phòng tránh tạp nhiễm phải không ảnh hướng đến bất cứ loài vi sinh vật nào có thể phát hiện được trong mẫu thử. Nếu mẫu thử có chứa chất ức chế vi sinh vật thì cần phải loại. bỏ hoặc trung hòa trước khi thử nghiệm. Khi sử dụng chất bất hoạt, cần chứng minh khả năng bất hoạt của chúng và đảm báo chất bất hoạt đó không chứa độc tố với vi sinh vật. Khi sử dụng chất diện hoạt trong quá trình chuẩn bị mẫu thử, phải đảm bảo chất diện hoạt đó không chứa độc tố với vi sinh vật và chất diện hoạt phải tương thích với chất bất hoạt khác cũng được sử dụng.
Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật
Sử dụng phương pháp màng lọc hoặc phương pháp đĩa thạch. Phương pháp MPN (Most Probable Number) nói chung có độ chính xác thấp nhất trong số các phương pháp đếm vi sinh vật, tuy nhiên, với mẫu thử có số lượng vi sinh vật rất thấp thì đây lại là phương pháp phù hợp nhất.
Lựa chọn phương pháp thử dựa trên nhiều yếu tố như bàn chất của mẫu thử và giới hạn vi sinh vật cho phép. Phương pháp được lựa chọn phải đảm bảo tiến hành trên lượng mẫu đủ để đánh giá được mẫu thử đáp ứng theo tiêu chuẩn, cần phải xác định sự phù hợp của phương pháp đã lựa chọn.
Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, chứng âm tính
Yêu cầu chung
Phải chứng minh phương pháp thử có khả năng phát hiện vi sinh vật khi có mặt mẫu thử. Phải chứng minh sự phù hợp của phương pháp khi có sự thay đổi trong quá trình tiến hành thử nghiệm hoặc có sự thay đôi về sản phẩm làm ảnh hướng đến kết quả của phép thử.
Chuẩn bị chủng vi sinh vật
Có thể sử dụng hỗn dịch chủng vi sinh vật ổn định đã được tiêu chuẩn hóa hoặc chuẩn bị như trình bày dưới dây. Kỹ thuật lưu giữ chủng gốc phải đảm bảo vi sinh vật được cấy truyền không quá 5 lần từ giống gốc ban đầu. Cấy các chủng vi sinh vật và nấm riêng rẽ theo Bảng 13.6.1.
Sử dụng dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7.0 hoặc dung dịch đệm phosphat pH 7,2 để pha hỗn dịch chủng vi sinh vật. Để pha hỗn dịch A.niger, thêm polysorbat 80 (TT) với tỷ lệ 0,05% vào dung dịch đệm. Hỗn dịch được sử dụng trong vòng 2h, nếu bảo quản ớ 2°C đến 8°C thì có thể sử dụng trong vòng 24h. Ngoài ra, đối với A.niger và B.subtilis, thay vì chuẩn bị và pha loãng hỗn dịch chủng dạng sinh dưỡng thì có thể sử dụng hỗn dịch bào tử ổn định. Hỗn dịch bào tử được bảo quản ở 2°C đến 8oC trong khoảng thới gian đã được thẩm định.
Chứng âm tính
Để đánh giá điều kiện thử nghiệm, tiến hành mẫu chứng âm tính bằng cách sử dụng dung dịch pha loãng thay cho mẫu thử. Mẫu chứng âm tính phải không được có vi sinh vật phát triển. Mẫu chứng âm tính cũng có thể được tiến hành củng lúc với mẫu thử như mô tả trong phần Cách tiến hành. Cần phải xem xét hệ thống kỹ lưỡng khi mẫu chứng âm tính không đạt.
Kiểm tra chất lượng môi trường
Tiến hành kiểm tra chất lượng đối với mỗi lô môi trường pha chế sẵn hoặc mỗi lô môi trường được pha chế từ môi trường khô hay từ các thành phần riêng lẻ. Cấy riêng rẽ vào môi trường thạch casein đậu tương hay môi trường lỏng casein đậu tương một lượng nhỏ vi sinh vật (không quá 100CFU) theo chỉ dẫn trong Bảng 13.6.1. Cấy riêng rẽ vào môi trường thạch Sabouraud-dextrose một lượng nhỏ vi sinh vật (không quá 100 CFU) theo chỉ dân trong Bảng 13.6.1. Ủ môi trường theo điều kiện ghi trong Bảng 13.6.1.
Đối với môi trường thạch, số lượng vi sinh vật phát triển trên lô môi trường mới không được khác quá 2 lần so với số lượng tính được của hỗn dịch chủng đã được tiêu chuẩn hóa. Đối với chủng được pha chế khi dùng, sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường mới sẽ được so sánh với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.
Đối với môi trường lỏng, sự phát triển rõ ràng của vi sinh vật trên lô môi trường mới được so sánh với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.
Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đểm khi có mặt mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử: Phương pháp chuẩn bị mẫu thử phụ thuộc vào tính chất vật lý của mẫu thử. Nếu không thể áp dụng cách nào trong các cách dưới đây, có thể sử dụng biện pháp khác để xử lý mẫu.
Mẫu thử tan trong Nước: Hòa tan hoặc pha loãng (thửớng pha loăng 10 lần) mẫu thử trong dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0, dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc môi trường lỏng casein đậu tương. Điều chỉnh đến pH 6 đến 8, nếu cần. Có thể pha loãng tiếp nếu cần bằng củng dung dịch pha loãng.
Mẫu thử có bản chất không phải chất béo, không tan trong Nước: Pha loãng mẫu thử (thường pha loãng 10 lần) trong dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0, dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc môi trường lỏng casein đậu tương. Có thể thểm chất diện hoạt như polysorbat 80 (TT) với tỷ lệ 1g/L để tăng khả năng thấm Nước của mẫu thử. Điều chỉnh đến pH 6 đến 8 nếu cần. Có thể pha loãng tiếp nêu cần bằng củng dung dịch pha loãng.
Mẫu thử có bản chất là chất béo: Hòa mẫu thử trong isopropyl myristat (TT) đã được tiệt khuẩn trước bằng cách lọc qua màng lọc hoặc trộn mẫu thử với lượng nho nhát có thể polysorbat 80 (TT) vô khuẩn hoặc một chất diện hoạt khác không có tính ức chế, làm nóng nếu cần ở nhiệt độ không quá 40°C, trong một số ít trường hợp có thể sử dụng nhiệt độ không quá 45oC. Trộn cẩn thận và nếu cần có thể duy trì trong bể ổn nhiệt. Thểm vừa đủ lượng dung dịch pha loăng đã được làm ấm sẵn để thu được độ pha loãng 10 lần. Duy trì nhiệt độ trong thới gian ngắn nhất và trộn cẩn thận để thu được nhũ dịch. Có thể tiếp tục pha loãng theo cấp số 10, trong đó dung dịch pha loăng được bổ sung polysorbat 80 (TT) hoặc chất diện hoạt không có tính ức chế khác với nồng độ thích hợp.
Dung dịch hoặc chất rắn dưới dạng aerosol: Chuyển mẫu thử lên màng lọc trong điều kiện vô khuẩn hoặc chuyển sang bình chứa vô khuẩn để tiếp tục lấy mẫu. Có thể sử dụng toàn bộ lượng mẫu hoặc một sổ liều nhất định tử các đơn vị đóng gói đểm thử.
Thuốc dán: Loại bỏ lớp bào vệ bên ngoài và dặt miếng dán (mặt dính ngừa lên trên) vào bình vô khuẩn. Phủ lên bề mặt miếng dán một loại vật liệu xốp vô khuẩn, ví dụ tấm gạc vô khuẩn, để tránh cho các miếng dán dính vào nhau và cho vào miếng dán một lượng dung dịch pha loãng thích hợp có chứa chất bất hoạt như polysorbat 80 (TT) và/hoặc lecithin. Lac kỹ ít nhất 30 min.
Cấy chủng và pha loãng:
Thểm vào mẫu thử đã được xử lý như mô tả ớ phần Chuẩn bị mẫu thử của mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử và thểm vào ống chứng (không có mẫu thử) một lượng hỗn dịch vi sinh vật có chứa không quá 100CFU. Thể tích của hỗn dịch vi sinh vật không được vượt quả 1% thể tích mẫu thử đã được pha loãng.
Để đánh giá độ phục hồi của vi sinh vật khi có mặt mẫu thử, tiến hành pha loãng mẫu thử ít nhất có thể. Nếu không thể pha loãng ít nhất do bản thân mẫu thử có tảc dụng ức chế vi sinh vật hoặc mẫu thử khó tan trong Nước, cần áp dụng các biện pháp phù hợp hơn. Nếu không thể loại bỏ được tảc dụng ức chế vi sinh vật của mẫu thử, nên thểm hỗn dịch vi sinh vật vào mẫu thử sau khi đã trung hòa, pha loãng hoặc lọc mẫu thử.
Trung hòa/loại bỏ tảc dụng của chất ức chế:
So sánh số lượng vi sinh vật hồi phục sau khi pha loăng như mô tả trong phần Cấy chủng và pha loãng và ủ như qui định trong phần Hồi phục vi sinh vật khi có mặt mẫu thử với sổ lượng vi sinh vật hồi phục của ống chứng.
Nếu có sự ức chế vi sinh vật phát triển (số lượng vi sinh vật giảm quá 2 lần), thì phải thay đổi qui trình đểm số lượng vi sinh vật để khẳng định tính có giá trị của thử nghiệm. Sự thay đổi này có thể là: (1) tăng thể tích dung dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cấy, (2) phối hợp chất trung hòa đặc hiệu hoặc chất trung hòa phổ biến trong dung dịch pha loãng. (3) áp dụng phương pháp màng lọc, (4) phối hợp các biện pháp nêu trên.
Chất trung hòa:
Một sổ chất được dủng để trung hòa tảc dụng của chất ức chế vi sinh vật (Bàng 13.6.2) được thểm vào dung dịch pha loãng hoặc môi trường nuôi cẩy trước khi hấp tiệt khuẩn. Trước khi sử dụng, phải tiến hành một mẫu trắng có chất trung hòa, không có mẫu thử để khẳng định hoạt tính của chất trung hòa và khẳng định chất trung hòa không có độc tính đối với vi sinh vật.
Bảng 13.6.2 – Một sổ chất trung hòa thông dụng
Nếu không tìm được phương pháp trung hòa phù hợp, có thể thấy việc không phân lập được vi sinh vật đã cấy vào mẫu thử cho thấy bản chất mẫu thử có tảc dụng ức chế. Điều này cho thấy mẫu thử sẽ không có khả năng bị tạp nhiễm các vi sinh vật đã thử. Tuy nhiên, rất có thể mẫu thử chỉ ức chế một số vi sinh vật đã thử mà không ức chế vi sinh vật ngoài danh mục các vi sinh vật đã thử. Khi đó, tiến hành thử nghiệm với độ pha loãng cao nhất tương thích với sự phát triển vi sinh vật và phù hợp với giới hạn nhiễm khuẩn cho phép của mẫu thử.
Hồi phục vi sinh vật khi có mặt mẫu thử: Đối với mỗi vi sinh vật được liệt kê trong Bảng 13.6.1, tiến hành các thí nghiệm riêng rẽ. Chỉ đếm vi sinh vật được cho vào mẫu thử.
- Phương pháp màng lọc:
Sử dụng màng lọc có kích thửớc lỗ lọc không quá 0,45µm. Bản chất màng lọc được lựa chọn sao cho khả năng lưu giữ vi sinh vật không bị ánh hướng bới các thành phần của mẫu thử. Đối với mỗi loại vi sinh vật được ghi trong Báng 13.6.1. sử dụng một màng lọc riêng.
Chuyển một lượng phù hợp mẫu thử (thửớng là lượng tương đương với 1g hoặc 1ml mẫu thử, hoặc lượng mẫu nhỏ hơn nếu dự đoán chứa nhiều vi sinh vật) đã được xử lý theo phần Chuẩn bị mẫu thử, Cấy chủng và pha loăng, Trung hòa/loại bỏ tảc dụng của chất ức chế lên màng lọc, lọc ngay và rửa màng lọc với thể tích thích hợp của dung dịch pha loãng.
Để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí, chuyển màng lọc lên bề mặt đĩa môi trường thạch casein đậu tương. Để đếm tổng số nấm, chuyển màng lọc lên bề mặt đĩa môi trường thạch Sabouraud-dextrose. Ủ các đĩa môi trường theo điều kiện ghi ớ Bảng 13.6.1. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc.
- Phương pháp đĩa thạch:
Với mỗi loại môi trường, tiến hành trên ít nhất 2 đĩa Petri và tính kết quả trung binh.
Phương pháp cấy trộn: Sử dụng đĩa Petri đướng kính 9 cm, thểm vào mỗi đĩa 1ml mẫu thử đã được xử lý theo phần Chuẩn bị mẫu thử, cấy chủng và pha loãng, Trung hòa/loại bỏ tức dụng của chất ức chế và 15ml đển 20ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch Sabouraud-dextrose, cả hai môi trường có nhiệt độ không quả 45oC. Nếu sử đụng đĩa Petri có đướng kính lớn hơn, thể tích môi trường phải tăng lên cho phù hợp. Đối với mỗi loại vi sinh vật được ghi trong Bảng 13.6.1, sử dụng ít nhất 2 đĩa Petri. Ủ các đĩa môi trường theo điều kiện ghi ớ Bảng 13.6.1. Tính trung bình số lượng khuẩn lạc đếm được đối với mỗi loại môi trường và từ đó tính ra số lượng vi sinh vật trong dịch cấy ban đầu.
Phương pháp cấy trải bề mặt: Sử dụng đĩa Petri đướng kính 9 crn, thểm vào mỗi đĩa 15ml đến 20ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch Sahouraud-dextrose ớ nhiệt độ khoáng 45oC và để môi trường đông, Nếu sử dụng đĩa Petri có đướng kính lớn hơn, thể tích môi trường phải tăng lên cho phù hợp. Làm khô đĩa. ví dụ trong buồng thổi khí sạch (laminar air flow) hoặc tủ ấm. Đối với mỗi loại vi sinh vật được ghi trong Bảng 13.6.1, sử dụng ít nhất 2 đĩa Petri. Trải lên bề mặt đĩa môi trường thể tích không dưới 0,1ml mẫu thử đã được xử lý theo phần Chuẩn bị mẫu thử, cấy chủng và pha loãng, Trung hòa/loại bỏ tảc dụng của chất ức chế. ủ và đếm số lượng khuẩn lạc giống mục Phương pháp cấy trộn.
- Phương pháp MPN (Most Probablc Number):
Phương pháp MPN có độ chính xác và độ đúng kém hơn so với phương pháp màng lọc hoặc phương pháp đĩa thạch. Kết quả đếm tổng số nấm bằng phương pháp MPN càng cho sai số nhiều hơn. Chính vì vậy, phương pháp MPN chỉ được sử dụng khi không thể áp dụng phương pháp nào khác. Nếu sử dụng phương pháp MPN, cần tuân thủ các bước sau.
Chuẩn bị ít nhất 3 nồng độ pha loãng 10 lần của mẫu thử đã được xử lý như phần Chuẩn bị mẫu thử, Cấy chủng và pha loãng, Trung hòa/loại bỏ tảc dụng của chất ức chế. Đối với mỗi độ pha loãng, cấy 1g hoặc 1ml vào 3 ống nghiệm có chứa 9ml đến 10ml môi trường lỏng casein đậu tương. Nếu cần, có thể thểm chất diện hoạt như polysorbat 80 (TT) hoặc các chất bất hoạt phù hợp khác vào môi trường. Như vậy, có tất cả 9 ống nghiệm cho 3 mức nồng độ pha loãng của mẫu thử.
Ủ tất cả các ổng nghiệm trên ớ 30oC đến 35 oC trong không quá 3 ngày. Nếu không thể đọc kết quả chính xác do bản chất mẫu thử gây khó khăn cho việc quan sát sự phát triển của vi sinh vật thì cấy chuyển sang môi trường lỏng casein đậu tương hoặc môi trường thạch casein đậu tương, ủ tiếp ớ nhiệt độ như trên trong 1 ngày đến 2 ngày, sau đó đọc kết quà. Xác định chỉ số MPN trong 1g hoặc 1ml mẫu thử theo Bảng 13.6.3.
Kết quả và đánh giá
Khi đánh giá sự phù hợp của phương pháp màng lọc hoặc phương pháp đĩa thạch, giá trị trung bình đếm được của các sinh vật thử phải không được khác quá 2 lần so với kết quả của ống chứng không chứa mẫu thử thu được theo phần Cấy chủng và pha loăng. Khi đánh giá sự phù hợp của phương pháp MPN, giá trị MPN phải nằm trong khoảng tin cậy 95 % của kết quả thu được của ống chứng. Nếu các yêu cầu trên không đáp ứng đối với một hoặc nhiều loại vi sinh vật đểm thử ớ tất cà phương pháp thử thì lựa chọn phương pháp và điền kiện thử nào có đáp ứng gần nhất yêu cầu trê.
Cách tiến hành
Lượng mẫu thử dủng cho thử nghiệm
Trừ khi có chỉ dẫn riêng, lấy 10g hoặc 10ml mẫu thử để tiến hành thử nghiệm trong điều kiện đảm bảo như đã đề cập ớ trên. Đối với thuốc khí dung chứa dung dịch hoặc chất rắn, tiến hành thử trên 10 đơn vị đóng gói. Đối với thuốc dán, tiến hành thử trên 10 miếng dán.
Lượng mẫu thử nghiệm có thể giảm xuống tuỳ theo lượng dược chất chính được đưa vào chế phẩm trong các trường hợp sau: Khối lượng dược chất chính không quá 1mg trong 1 đơn vị (1 viên nén, 1 nang, 1 ống hoặc lọ thuốc tiêm…) hoặc khối tượng dược chất chính trong 1g hoặc 1ml mẫu thử (đối với dạng chế phẩm đa liều) nhỏ hơn 1mg. Trong những trường hợp này, lượng mẫu thử nghiệm phải không được nhỏ hơn lượng mẫu có trong 10 đơn vị đóng gói hoặc 10g hoặc 10ml mẫu thử. Đối với mẫu thử là nguyên liệu nhưng có khối lượng rất hạn chế hoặc cỡ lô quá nhỏ (dưới 1000ml hoặc 1000g), lượng mẫu thử nghiệm bằng 1% cỡ lô, một số trường hợp lượng mẫu thử có thể nhỏ hơn và phải có qui định cụ thể. Đối với mẫu thử mà tổng số đơn vị trong một lô dưới 200 (ví dụ mẫu thử nghiệm lâm sàng), có thể tiến hành thử nghiệm trên 2 đơn vị, trường hợp cỡ lô nhỏ hơn 100 đơn vị, có thể tiến hành thử nghiệm trên 1 đơn vị.
Lấy mẫu nguyên liệu hoặc mẫu thử một cách ngẫu nhiên. Để thu được đủ lượng mẫu theo yêu câu, có thể phải trộn đều mẫu thử lấy từ các đơn vị đóng gói khác nhau.
Tiến hành
Phương pháp màng lọc:
Sử dụng dụng cụ lọc được thiết ké phù hợp, cho phép có thể chuyển màng lọc vào môi trường nuôi cấy. Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiếm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, chứng âm tính để chuẩn bị mẫu thử, và chuyển lượng mẫu thích họp lên 2 màng lọc và tiến hành lọc ngay. Rửa màng lọc bằng qui trình phù hợp.
Để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí, chuyển một màng lọc lên bề mặt môi trường thạch casein đậu tương. Để đếm tổng số nấm, chuyển một màng lọc lên bề mật môi trường thạch Sabouraud-dextrose.
Ủ đĩa chứa môi trường thạch casein đậu tương ớ 30°C đến 35°C trong 3 ngày đến 5 ngày và ủ đĩa chứa môi trường thạch Sabouraud-dextrose ớ 20°C đến 25oC trong 5 ngày đến 7 ngày, Tính số CFU (Colony Forming Unit) trong 1g hoặc 1ml mẫu thử.
Khi thử nghiệm với thuốc dán, lọc riêng rẽ 10% thể tích mẫu thử được chuẩn bị theo phần Chuẩn bị mẫu thử của mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử trên 2 màng lọc vô khuẩn. Chuyển một màng lọc lên bề mặt môi trường thạch casein đậu tương để đếm tổng số vi sinh vật hiếu khi và chuyển màng lọc còn lại lên bề mặt môi trường thạch Sabouraud-dextrose để đếm tổng số nấm.
Phương pháp đĩa thạch:
- a) Phương pháp cấy trộn:
Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, chứng âm tinh đề chuẩn bị mẫu thử. Tiến hành với ít nhất 2 đĩa Petri cho mỗi loại môi trường ớ mỗi nồng độ pha loãng. Ủ đĩa chứa môi trường thạch casein đậu tương ớ 30°C đến 35°C trong 3 ngày đến 5 ngày và ủ đĩa chứa môi trường thạch Sabouraud-dextrose ớ 20°C đến 25°C trong 5 ngày đến 7 ngày. Chọn các đĩa của một nồng độ pha loãng nhất định mà tại nồng độ pha loãng đó, sổ khuẩn lạc thu được là cao nhất và nhỏ hơn 250 đối với đĩa đếm tổng sổ vì sinh vật hiểu khí và nhỏ hơn 50 đối với đĩa đếm tổng số nấm. Từ đó tính giá trị trung bình đối với mỗi loại môi trường và tính số CFU trong 1g hoặc 1ml mẫu thử.
- b) Phương pháp cấy trải bề mặt:
Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, chứng âm tính để chuẩn bị mẫu thử. Tiến hành với ít nhất 2 đìa Petri cho mỗi loại môi trường ớ mỗi nồng độ pha loãng. Điều kiện ủ và cách tính kết quả giống phương pháp cấy trộn.
Phương pháp MPN:
Sử dụng phương pháp phù hợp theo mục Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp đếm, chứng âm tính để chuẩn bị mẫu thử. Ủ tất cả các ống nghiệm ớ 30°C đến 35C trong 3 ngày đến 5 ngày. Có thể cấy chuyển nếu cần theo qui trình phù hợp. Tại mỗi nồng độ pha loãng, ghi lại số lượng ổng nghiệm có vi sinh vật phát triển. Xác định số lượng vi sinh vật trong 1g hoặc 1ml mẫu thử theo Bảng 13.6.3.
Đánh giá kết quả
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được coi là số khuẩn lạc đếm được trên môi trường thạch casein đậu tương. Khuẩn lạc nấm phát hiện được trên môi trường này cũng được coi là một phần của tổng số vi sinh vật hiếu khí. Tổng số nấm được coi là số khuẩn lạc đếm được trên môi trường thạch Sabouraud-dextrose. Khi tổng số nấm vượt quá giới hạn chấp nhận của mẫu thử do vi khuẩn mọc trên môi trường này, có thể thểm kháng sinh vào môi trường thạch Sabouraud-dextrose (ví dụ 50mg cloramphenicol vào 1L môi trường trước khi hấp tiệt khuẩn), số lượng vi sinh vật đếm được bằng phương pháp MPN được coi là tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nếu không thấy có khuẩn lạc mọc trên đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10CFU trong 1g hoặc 1ml.
Dựa vào giới hạn nhiễm khuẩn cho phép, có thể đánh giá như sau:
101 CPU: Số lượng tối đa được chấp nhận = 20;
102 CFU: Số lượng toi đa được chấp nhận – 200;
103 CFU: Sổ lượng tối đa được chấp nhận = 2000 và cứ tiếp tục như vậy.
Các dung dịch và môi trường nuôi cấy được liệt kê trong mục Dung dịch pha loãng với môi trường.
XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT GẢY BỆNH
Giới thiệu
Phép thử sau đây cho phép xác định sự không hiện diện hoặc hiện diện với số lượng hạn chế của một số vi sinh vật gây bệnh trong mẫu thử dưới những điều kiện đã qui định. Phép thử nhằm đánh giá chế phẩm thử có đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng đã công bố về chỉ tiêu vi sinh vật hay không. Khi sừ dụng phép thử cho mực đích này, cần tuân thủ theo chỉ dẫn phía dưới về số lượng mẫu đểm thử, đánh giá kết quả.
Có thể sử dụng qui trình xác định vi sinh vật khác, bao gồm cả các phương pháp lự động, khi chứng minh được tính tương đương của chúng với phương pháp ghi trong dược điển.
Qui định chung
Chuẩn bị mẫu thử theo mô tả ớ phần Chuẩn bị mẫu thử. Nếu mẫu thử có chứa chất ức chế vi sinh vật, cần loại bỏ hoặc trung hòa chất ức chê như mô tả trong phần Trung hòa/loại bỏ tảc dụng của chất ức chế.
Khi sử dụng chất diện hoạt trong quá trình chuẩn bị mẫu thử, phải đảm bảo chất diện hoạt đó không chứa độc tố với vi sinh vật và chất diện hoạt phải tương thích với chất bất hoạt khác củng được sử dụng như mô tả trong phần Trung hàa/loại bỏ tảc dụng của chất ức chế,
Kiểm tra chất lượng môi trường, sự phù hợp của phương pháp, chứng âm tính
Phải chứng minh phương pháp thử có khả năng phát hiện vi sinh vật khi có mặt mẫu thử.
Phải chứng minh sự phù hợp của phương pháp khi có sự thay đổi trong quá trình tiến hành thí nghiệm hoặc có sự thay đổi về sản phẩm làm ảnh hướng đến kết quả của phép thử. Chuẩn bị chủng vi sinh vật Có thể sử dụng hỗn dịch chủng vi sinh vật ổn định đã được tiêu chuẩn hóa hoặc chuẩn bị như trình bày dưới đây. Kỹ thuật lưu giữ chủng gốc phải đảm bảo vi sinh vật được cấy truyền không quá 5 lần lừ giống gốc ban đầu.
Chủng vi sinh vật hiếu khí:
Cấy chủng vi sinh vật thử nghiệm riêng rẽ trên môi trường lỏng casein đậu tương hoặc môi trường thạch casein đậu tương và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 24h. cấy chủng Candida albicans riêng rẽ trên môi trường thạch Sabouraud-dextrose hoặc môi trường lỏng Sabouraud- dextrose và ủ ớ 20°C đến 25°C trong 2 ngày đến 3 ngày. Staphlylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB 9518, CJP 4.83 hoặc NBRC 13276
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 hoặc NBRC 13275 Eschếrichia coli ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126, hoặc NBRC 3972
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028 hoặc có thể thav thế bảng Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abonv NBRC 100797, NCTC 6017, hoặc CIP 80.39
Candida albicans ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 hoặc NBRC 1594.
Sử dụng dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0 hoặc dung dịch đệm pbosphat pH 7,2 để pha hỗn dịch chủng vi sinh vật. Hỗn dịch được sử dụng trong vòng 2h, nếu bảo quản ớ 2°C đến 8°C thỉ có thể sử dụng trong vòng 24h.
Clostridia:
Sử dụng chủng Clostridium sporogenes ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) hoặc ATCC 19404 (NCTC 532 hoặc CÍP 79.3). Cấy chủng Clostridia trên môi trường tăng sinh cho Clostridia và ủ trong điều kiện kỵ khí ớ 30oC đến 35oC trong 24h đến 48h. Ngoài ra, thay vì chuẩn bị chủng CL.sporogenes dạng sinh dưỡng như ớ trên, có thể sử dụng hỗn dịch bảo tử ổn định. Hỗn dịch bào tử được bao quản ớ 2°C đến 8°C trong khoảng thới gian đã được thẩm định.
Chứng âm tính
Để đánh giá điều kiện thử nghiệm, tiến hành mẫu chứng âm tính bằng cách sử dụng dung dịch pha loãng thay cho mẫu thử. Mẫu chứng âm tính phải không được có sự phát triển của vi sinh vật. Mẫu chứng âm tính cũng có thể được tiến hành củng lúc với mẫu thử như mô tả trong mục Cách tiến hành. Cần phải xem xét hệ thống kỹ lưỡng khi mẫu chứng âm tính không đạt.
Kiểm tra chất lượng môi trường
Tiến hành kiểm tra chất lượng đối với mỗi lô môi trường pha chế sẵn hoặc mỗi lô môi trường được pha chế từ môi trường khô hay từ các thành phần riêng lẻ.
Kiểm tra chất lượng môi trường theo chỉ dẫn trong Bảng 13.6.4.
Thử nghiệm kiểm tra khả năng kích thích sự phát triển vi sinh vật của môi trường lỏng:
Cấy vào môi trường lỏng một lượng nhỏ vi sinh vật phù hợp (không quá 100 CFU). Ủ ớ nhiệt độ xác định trong thới gian không lâu hơn khoảng thới gian ngắn nhất mà phép thử qui định. Vi sinh vật phát triển tốt, rõ ràng trên lô môi trường mới khi so sánh với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.
Thử nghiệm kiểm tra khả năng kích thích sự phát triển Vi sinh vật của môi trường đặc:
Dủng kĩ thuật cấy trải bề mặt. cấy vào mỗi đĩa môi trường đặc một lượng nhỏ vi sinh vật phù hợp (không quá 100CFU). Ủ ớ nhiệt độ xác định trong thới gian không lâu hơn khoảng thới gian ngắn nhất mà phép thử qui định. So sánh sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường mới với sự phát triển của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.
Thử nghiệm kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi sinh vật của môi trường lỏng và đặc:
Cấy vào môi trường loại vi sinh vật phù hợp với lượng ít nhất là 100CFU. Ủ ớ nhiệt độ xác định trong thới gian không ít hơn khoảng thới gian dài nhất mà phép thử qui định. Vi sinh vật phải không phát triển trên môi trường.
Thử nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu của môi trường:
Dủng kĩ thuật cấy trải bề mặt. cấy vào mỗi đĩa môi trường một lượng nhỏ vi sinh vật phù hợp (không quá 100CFU). Ù ớ nhiệt độ xác định trong thới gian mà phép thử qui định. So sánh hình thái khuấn lạc và phân ứng đặc hiệu của vi sinh vật trên lô môi trường mới với hình thái khuẩn lạc và phản ứng đặc hiệu của vi sinh vật trên lô môi trường đã đạt yêu cầu chất lượng.
Sự phù hợp của phương pháp thử
Đối với mỗi mẫu thử, tiến hành chuẩn bị mẫu thử như mô tả trong mục Cách tiến hành, cấy chủng vi sinh vật chứng vào môi trường nuôi cấy tại thới điểm trộn mẫu thử vào môi trường, cấy các chủng vi sinh vật một cách riêng rẽ. So lượng vi sinh vật được cấy vào mẫu thử với lượng không quá 100CFU.
Tiến hành thử nghiệm như mô tả trong mục Cách tiến hành và ủ trong thới gian ngắn nhất mà phép thử qui định. Vi sinh vật gây bệnh được phát hiện bằng các phản ứng đặc hiệu được mô tả trong mục Cách tiến hành. Nếu bản chất mẫu thử có tính ức chế vi sinh vật, cần thay đổi qui trình thử cho phù hợp (xem phần Trung hòa/loại bỏ tảc dụng của chất ức chế).
Với mẫu thử có tính ức chế vi sinh vật nhưng phương pháp đã thử không thể trung hòa hoạt tính ức chế này được thì mẫu thử được coi là không bị nhiễm các vi sinh vật đã được thử nghiệm.
Cách tiến hành
Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật
Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:
Lấy không dưới 1g hoặc 1ml mẫu thử, pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mật mẫu thử chỉ khác là dủng môi trường lỏng cascin đậu tương thay cho dung dịch pha loãng, trộn đều và ủ ớ 20°C đến 25°C trong một thới gian thích hợp để phục hồi lại vi khuẩn mà không làm tăng số lượng vi khuẩn (thửớng từ 2h đến không quá 5h).
Phát hiện vi khuẩn:
Trừ khi có chỉ dẫn riêng, chuyển một thể tích tương đương với 1g hoặc 1ml mẫu thử được chuẩn bị ớ phần Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ vào 100ml môi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria-Mossel. Ủ ớ 30oC đến 35°C trong 24h đến 48h. Cấy chuyển lên môi trường thạch muối mật tím đỏ. Ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 24h. Mẫu thử không có Enterobactcria nếu không thay khuẩn lạc mọc trên môi trường.
Đánh giá số lượng:
Phân lập và cấy chuyển: cấy lượng mẫu thử đã được chuẩn bị theo phần Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ tương ứng chứa 0,1g; 0,01g và 0.001g hoặc 0,1ml; 0,01ml và 0,001ml vào thể tích thích hợp môi trường lỏng tăng sinh Enterobacteria-Mossel. Ủ ớ 30°C đến 35°C trong 24h đến 48h. Cấy chuyển từ mỗi ống môi trường trên sang môi trường thạch muối mật tím đỏ. Ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 24h.
Đánh giá kết quả: Khuẩn lạc mọc trên môi trường chứng tỏ kết quả dương tính. Ghi lượng nhỏ nhất của chế phẩm mà ớ đó cho kết quả dương tính và lượng lớn nhất của chế phẩm mà ớ đó cho kết quả âm tính. Xác định số lượng vi khuẩn theo Bảng 13.6.5.
Escherichia coii
Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:
Lấy không dưới 1g hoặc 1ml, pha loãng 10 lần như mô tả trong phân Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử. Cấy 10ml hoặc một lượng tương ứng với 1g hoặc 1ml mẫu thử vào một thể tích phù hợp môi trường lòng casein đậu tương, trộn đều và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 24h.
Phân lập và cấy chuyển:
Lắc bình môi trường lỏng casein đậu tương, cấy chuyển 1ml môi trường lỏng casein đậu tương sang 100ml môi trường lỏng MacConkev và ủ ớ 42°C đến 44°C trong 24h đến 48h. Tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch MacConkey và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 72h.
Đánh giá kết quả: Khuẩn lạc mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có E.Coli. Tiếp tục xác định bằng nhiều phản ứng sinh hóa khác.
Mẫu thử không có E.Coli nếu không có khuẩn lạc mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa để xác định E.Coli có kết quá âm tính.
Salmonella
Chuẩn bị mẫu thử và tiên ủ:
Lấy lượng mẫu thử đã xử lý như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử tương ứng với 10g hoặc 10ml mẫu thử và cấy vào một thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn đều và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 24h.
Phân lập và cấy chuyển:
Cấy chuyển 0,1ml môi trường lỏng casein đậu tương sang 10ml môi trường tăng sinh Salmonella Rappaport Vassiliadis và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 24h. Tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch xylose, lysin, deoxycholat và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 48h.
Đánh giá kết quả:
Khuẩn lạc màu đỏ, có hoặc không có trung tâm màu đển mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có Salmonella. Tiếp tục xác định bằng nhiều phản ứng sinh hóa khác.
Mẫu thử không có Salmonella nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ớ trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa để xác định Salmonella có kết quả âm tính.
Pseudomonas aeruginosa
Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:
Lấy không dưới 1g hoặc 1ml mẫu thử, pha loãng 10 lần như mô tả trong phần chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử. Cấy 10ml hoặc 1 lượng tương ứng với 1g hoặc 1ml mẫu thử vào một thể tích phù hợp môi trường long casein đậu tương, trộn đều. Đối với thuốc dán. lọc một lượng mẫu thử tương đương với miếng dán như mô tã trong phần chuẩn bị mau thử của mục Kiểm tra sự phù hợp của phưong pháp đếm khi có mặt mẫu thử qua màng lọc vô khuẩn và cấy vào 100ml môi trường lòng casein đậu tưong. u ớ 30°C đên 35°C trong 18h đến 24h.
Phân lập và°cấy chuyển:
Cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch cetrimid và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 72h.
Đánh giá kết quả:
Khuẩn lạc mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có P.aeruginosa. Tiếp tục xác định bằng nhiêu phản ứng sinh hóa khác.
Mẫu thử không có P.aeruginosa nếu không có khuẩn lạc mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa để xác định P.aeruginosa có kết quả âm tính.
Staphylococcus aureus
Chuẩn bị mẫu thử và tiền ủ:
Lấy không dưới 1g hoặc 1ml mẫu thử. pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử. Cấy 10ml hoặc 1 lượng tương ứng với 1g hoặc 1ml mẫu thử vào một thể tích phù hợp môi trường lỏng casein đậu tương, trộn đều. Đối với thuốc dán, lọc một lượng mẫu thử tương đương với 1 miếng dán như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử qua màng lọc vô khuẩn và cấy vào 100ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 24h.
Phân lập và cấy chuyển:
Cấy chuyển sang đĩa môi trường thạch muối manitol và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 18h đến 72h.
Đánh giá kết quả:
Khuẩn lạc màu vàng hoặc trắng cổ vòng màu vàng bao quanh mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có S.aureus. Tiếp tục xác định bằng nhiều phản ứng sinh hóa khác.
Mẫu thử không có S.aureus nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ớ trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa để xác định S.aureus có kết quả âm tính.
Clostridia
Chuẩn bị mẫu thử và sốc nhiệt:
Chuẩn bị tối thiểu 20ml mẫu thử được pha loãng 10 lần như mô tả trong phần Chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử tương ứng với không dưới 2g hoặc 2ml mẫu thử. Chia mẫu thử thành 2 phần, mỗi phần ít nhất 10ml. Một phần dun nóng tới 80°C trong 10min rồi làm lạnh ngay. Phần còn lại không được đun nóng.
Phân lập và cấy chuyển:
Cấy 10ml hoặc lượng tương đương với 1g hoặc 1ml mẫu thử của cà 2 phần trên vào thể tích phù hợp môi trường tăng sinh cho Clostridia, ủ cả hai mẫu ớ điều kiện ky khí ớ 30°C đến 35°C trong 48h. Sau khi ủ, từ mỗi bình cấy chuvển sang môi trường thạch Columbia và tiếp tục ủ ớ điều kiện kỵ khí ớ 30°C đến 35°C trong 48h đến 72h.
Đánh gía kết quả:
Sự phát triển của trực khuẩn trong điều kiện kỵ khí (có hoặc không có bào tử) trên môi trường, phản ứng catalase âm tính cho thấy mẫu thử có thể có Clostridia. Tiếp tục xác định bằng nhiều phản ứng sinh hóa khác.
Mẫu thử không có Clostridia nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ớ trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa để xác định Clostridia có kết quả âm tính.
Candida albicans
Chuẩn bị mẩu thử và tiền ủ:
Chuẩn bị mẫu thử như mô tả trong phần chuẩn bị mẫu thử mục Kiểm tra sự phù hợp của phương pháp đếm khi có mặt mẫu thử, cấy 10ml hoặc một lượng tương ứng với 1g hoặc 1ml vào 100ml môi trường lỏng Sabouraud-dextrose, trộn đều và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 3 ngày đến 5 ngày.
Phân lập và cấy chuyển: cấy chuyển sang môi trường thạch Sabouraud-dextrose và ủ ớ 30°C đến 35°C trong 24h đến 48h.
Đánh giá kết quả:
Khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trường cho thấy mẫu thử có thể có C.albicans. Tiếp tục xác định bằng nhiều phản ứng sinh hóa khác.
Mẫu thử không có C.albicans nếu không có khuẩn lạc có đặc điểm mô tả ớ trên mọc trên môi trường hoặc các phản ứng sinh hóa để xác định C.albicans có kết quả âm tính.
DUNG DỊCH PHA LOẰNG VÀ MÔI TRƯỜNG
Các dung dịch và môi trường nuôi cấy được chuẩn bị theo cách dưới đây. Có thể sử dụng môi trường khác khi chứng minh được sự phù hợp của chúng.
Dung dịch đệm gốc
Cân 3 – 4g kali dihydrophosphat (TT) và cho vào bình định mức 1000ml, thêm 500ml nước tinh khiết, điều chỉnh pH 7,2 ± 0,2 băng natri hvdroxyd (TT). Thêm nước tinh khiết tới vạch, trộn đều. Phân chia vào các bình, tiệt khuẩn, bào quản ớ 2°C đến 8°C.
Dung dịch đệm phosphat pH 7,2
Pha loãng dung dịch đệm gốc với nước tinh khiết theo tỷ lệ 1 : 800 (tt/tt) và tiệt khuẩn.
Dung dịch đệm natri clorid-pepton pH 7,0
| Kali dihydrophosphat | 3,6g |
| Dinatri hydrophosphat dihydrat | 7,2g tưcmg ứng với 0,067 Mphosphat |
| Natri clorid | 4,3g |
| Pepton (từ thịt hoặc casein) | 1,0g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định | |
Môi trường lỏng casein đậu tương
| Casein thủy phân bới pancreatin | 17.0g |
| Bột đậu tương thuỷ phân bới papain | 3.0g |
| Natri clorid | 5.0g |
| Dikali hydrophosphat | 2.5g |
| Glucose monohydrat | 2.5g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,3 ± 0,2 ớ 25°C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. | |
Môi trường thạch Sabouraud-dextrose
| Dextrose | 40,0g |
| Casein thủy phân bới pancreatin | 5,0g |
| Pepton từ mô động vật | 5,0g |
| Thạch | 15.0g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5,6 ± 0,2 ớ 25. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy có trình đã được thấm định. | |
Môi trường thạch khoai tây dextrose
| Dịch chiết từ khoai tây | 200.0g |
| Dextrose | 20.0g |
| Thạch | 15.0g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5.6 ± 0,2 ớ 25oC. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. | |
Môi trường lỏng Sabouraud-dextrose
| Dextrose | 20.0g |
| Casein thủy phân bới pancreatin | 5.0g |
| Pepton từ mô động vật | 5.0g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5,6 ± 0,2 ớ 25°C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. | |
Môi trường lỏng tăng sình Enterobacteria-Mossel
| Genlatin thủy phân bới pancreatin | 10.0g |
| Glucose monohydrat | 5.0g |
| Mật bò khô | 20.0g |
| Kali dihyđrophosphat | 2.0g |
| Dinatri hydrophosphat dihydrat | 8.0g |
| Xanh brilliant | 15mg |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn, môi trường có pH 7.2 + 0,2 ớ 25°C. Tiệt khuẩn bằng nhiệt ớ 100°C trong 30 min và làm lạnh ngay | |
Môi trường thạch muối mật tím đỏ
| Cao nấm men | 3.0g |
| Gelatin thủy phân bới pancreatin | 7.0g |
| Muối mật | 1.5g |
| Natri clorid | 5.0g |
| Glucose monohydrat | 10.0g |
| Thạch | 15.0g |
| Đỏ trung tính | 30mg |
| Tím tinh thể | 2mg |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn, môi trường có pH 7.4 ± 0,2 ớ 25°C. Tiệt khuẩn bằng cách đun sôi, không được hấp trong nồi hấp. | |
Môi trường lóng MacConkey
| Gelatin thủy phân bới pancreatin | 20.0g |
| Lactose monohyđrat | 5.0g |
| Mật bò khô | 5.0g |
| Tía bromocrcsol | 10mg |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,3 ± 0,2 ớ 25°C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thấm định. | |
Môi trường thạch MacConkey
| Gelatin thủy phân bới pancreatin | 17.0g |
| Pepton (thịt hoặc casein) | 3.0g |
| Lactose monohydrat | 10.0g |
| Natri clorid | 5.0g |
| Muối mật | 1.5g |
| Thạch | 13.5g |
| Đỏ trung tính | 30.0mg |
| Tím tinh thể | 1.0mg |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,1 ± 0,2 từ 25°C. Đun sôi 1min, sau đó hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. | |
Môi trường lỏng tăng sinh Salmonella Rappaport Vassiliadis
| Pepton đậu tương | 4.5g |
| Magnesi clorid hexahydrat | 29.0g |
| Natri clorid | 8.0g |
| Dikali phosphat | 0.4g |
| Kali dihydrophosphat | 0.6g |
| Xanh malachit | 0.036g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Hòa tan, đun nóng nhẹ. Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định với nhiệt độ không quá 115°C. Điểu chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 5,2 ± 0,2 ớ 25°C | |
Môi trường thạch xylose, lysin, desoxycholat
| Xylose | 3.5g |
| L-Lysin | 5.0g |
| Lactose monohỵdrat | 7.5g |
| Sucrose | 7.5g |
| Natri clorid | 5.0g |
| Cao nấm men | 3.0g |
| Đỏ phenol | 80mg |
| Thạch | 13.5g |
| Natri desoxycholat | 2.5g |
| Natri thiosulfat | 6.8g |
| Sắt amoni citrat | 0.8g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,4 ± 0,2 ớ 25°C. Đun sôi, để nguội đến 50°C thì rót môi trường vào đĩa Petri. Không được hấp tiệt khuẩn trong nổi hấp. | |
Môi trường thạch cetrimid
| Gelatin thủy phân bới pancreatin | 20.0g |
| Magnesi ciorid | 1.4g |
| Dikali sulfat | 10.0g |
| Cetrimid | 0.3g |
| Thạch | 13.6g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Glycerol | 10ml |
| Đun sôi trong 1min, khuấy đều. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,2 ± 0,2 ớ 25°C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. | |
Môi trường thạch muối manitol
| Casein thủy phân bới pancrcatin | 5.0g |
| Pepton từ mô động vật | 5.0g |
| Cao thịt bò | 1.0g |
| D-Manitol | 10.0g |
| Natri clorid | 75.0g |
| Thạch | 15.0g |
| Đỏ phenol | 0.025g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Đun sôi trong 1min, khuấy đều. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7,4 ± 0,2 ớ 25°C. Tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. | |
Môi trường tăng sinh cho Clostridia
| Cao thịt bò | 10.0g |
| Pepton | 10.0g |
| Cao nấm men | 3.0g |
| Tinh bột dễ tan | 1.0g |
| Glucose monohydrat | 5.0g |
| Cystein hydroclorid | 0.5g |
| Natri clorid | 5.0g |
| Natri acetat | 3.0g |
| Thạch | 0.5g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Làm ẩm thạch, hòa tan các thành phần bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 6,8 ± 0,2 ớ 25°C. Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định | |
Môi trường thạch Columbi
| Casein thủy phân bới pancrcatin | 10.0g |
| Pepton từ thịt | 5.0g |
| Tim thủy phân bới pancrcatin | 3.0g |
| Cao nấm men | 5.0g |
| Tinh bột ngô | 1.0g |
| Natri clorid | 5.0g |
| Thạch | 10.0g đến 15.0g |
| Nước tinh khiết | 1000ml |
| Làm ẩm thạch, hòa tan bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Điều chỉnh pH sao cho sau khi hấp tiệt khuẩn, môi trường có pH 7.3 ± 0,2 ớ 25°C. Hấp tiệt khuẩn trong nồi hấp theo quy trình đã được thẩm định. Để nguội tới 45°C đến 50°C, nếu cần, thêm 20 mg gentamycin base và rót vào đĩa Petri | |
.
YÊU CẦU GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN
Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng thì giới hạn nhiễm khuẩn cho các loại thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất được ghi trong Bảng 13.6.6.
