5. CÁC KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ38 min read

Các kỹ thuật tách sắc ký là những phương pháp tách trong đó các thành phần của mẫu được phân bố vào hai pha: một pha tĩnh và một pha động. Pha tĩnh có thể là một chất rắn. cũng có thể là một chất lòng được giữ trên một chất rắn hay một gel. Pha tĩnh có thể được nhồi vào cột, hoặc trải thành một lớp, hay phân tán thành một lớp phim v.v… Pha động có thể là chất khi, chất lỏng hay chất lưu siêu tới hạn (còn được gọi là chất lỏng siêu tới hạn). Sự tách sắc ký có thể dựa trên các cơ chế khác nhau như hấp phụ, phân bố khối lượng (hay phân chia), trao đổi ion, hoặc dựa trên sự khác nhau về tính chất lý hóa của các phân tử như kích thước, khối lượng, thể tích v.v…

Phụ lục này chi đề cập đến các định nghĩa và phép tính các thông số thông thường trong kỹ thuật sắc ký, các yêu cầu thường được áp dụng cho sự phù hợp của hệ thống sắc ký. Nguyên lý, thiết bị và phương pháp tách được trình bày trong các phép thử chung sau đây:

• Phương pháp sắc ký giấy (Phụ lục 5.1)
• Phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2)
• Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3)
• Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5,4)
• Phương pháp sắc ký rây phân tử (Phụ lục 5.5)

Định nghĩa

Các định nghĩa sau đây được dùng trong các chuyên luận để tính toàn các thông số về tinh phù hợp của hệ thống và các tiêu chuẩn chấp nhận. Một số thiết bị có phần mềm của nhà sản xuất dùng để tính toán một vài thông số như tỷ sổ tin hiệu trên nhiễu và độ phân giải có thể được sử dụng. Trong trường hợp này, người sử dụng có trách nhiệm đảm bảo rằng các phương pháp dùng trong phần mềm đỏ phù hợp với yêu cầu của bộ tiêu chuẩn này; nếu không, phải điều chỉnh cho phù hợp.

Sắc ký đồ

Sắc ký đổ là một đồ thị hay một cách trinh hay khác mô tả sự thay đổi đáp ứng của detector (hay nồng độ của chất hay một đại lượng khác làm thước đo nồng độ của chất) theo thời gian, thể tích hay khoảng cách. Một sắc ký đồ lý tưởng có dạng một chuỗi các pic kiểu Gauss trên một đường nền (Hình 5.1).

Thời gian lưu (t_R)

Là thời gian cần thiết đề rùa giải một chất (Hinh 5.1, dưởng nền biểu thị bằng phút).

Pic

Pic, hay còn gọi là đỉnh, là phần sắc ký đồ ghi lại đáp ứng của detector khi một chất (hoặc 2 hay nhiều chất không tách ra khỏi nhau) được rửa giải khỏi cột. Pic có thể được xác định bằng diện tích pic, hoặc chiều cao pic (h) và chiều rộng pic ở nửa chiều cao (w_h), hoặc chiều cao pic (h) và chiều rộng pic giữa các điểm uốn (w_t). ở các pic có dạng hình Gauss (Hình 5.1), có moi quan hệ biểu thị bằng phương trình sau:

w_h = 1.18 * w_t

Thể tích lưu (V_R)

Là thể tích pha động cần thiết để rìra giãi một chất. Thể tích lưu có thể tính được từ thời gian lưu và tốc độ dòng (ml/min) theo công thức:

V_R = t_R * F

Trong đó:

F là lưu lượng dòng (hay tốc độ dòng) của pha dộng (ml/min).

Thòi gian chết (t_M) (hold-up time)

Là thời gian cần thiết để rửa giải một chất không bị lưu giữ (Hình 5.1, đường nên biểu thị bằng phút). Trong phương pháp Sắc ký rây phân từ (xem Hình 5.2), thời gian chết được ký hiệu là t₀.

Thể tích chết (V_M) (hold-up volume)

Là thể tích pha động cần thiết để rửa giải một chất không bị lưu giữ. Nó có thể được tính từ thời gian chết (t_M) và tốc độ dòng F (số ml pha động trong 1 min) theo công thức sau:

V_M = t_M * F

Trong phương pháp sắc ký rây phân tử (xem Hình 5.2), thể tích chết được ký hiệu là V₀.

Hệ số phân bố khối lượng

Hệ số phân bố khối lượng (D_m) hay còn gọi là thừa số dung lượng (k’), hoặc thừa số lưu giữ (k), được định nghĩa và tính theo công thức sau:

D_m = k’ = k = m_S / m_M = K_C * V_S / V_M

Trong đó:

K_C là hằng số phân bố hay còn gọi là hệ số phân bố cân bằng;

V_S là thể tích pha tĩnh;

V_M là thể tích pha động;

m_S là lượng chât trong pha tĩnh;

m_M là lượng chất trong pha động.

Thừa số lưu gìữ k của một chất có thể được xác định trên sắc ký đồ theo công thức:

k = (t_R – t_M)/t_M

Thời gian toàn bộ của pha động (t_t)

Trong phương pháp sắc ký rây phân tử, thời gian toàn bộ của pha động là thời gian lưu của một chất mà kích thước phân tử nhỏ bơn kích thước các lỗ nhỏ nhất của gel (Hình 5.2).

Thể tích toàn bộ của pha động (V_t)

Trong phương pháp sắc ký rây phân tử, thể tích toàn bộ của pha động là thể tích lưu của một chất mà kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước các lỗ nhỏ nhất của gel. Nó có thể được tính từ thời gian toàn bộ của pha động (t_t) và tốc độ dòng F(ml/min) theo còng thức sau:

K = t_t x F

Thời gian lưu của chất không bị lưu giữ (t_o)

Trong phương pháp sắc ký rây phân tử, thời gian lưu của chất không bị lưu giữ là thời gian lưu của một chất mà kích thước phân từ lớn hơn kích thước các lỗ lớn nhất của gel (Hình 5.2).

Thể tích lưu của chất không bị lưu giữ (V_o)

Trong phương pháp sắc ký rây phân tử, thể tích lưu của chất không bị lưu giữ là thể tích lưu của một chất mà kích thước phân tử lớn hơn kích thước các lỗ lớn nhất của gel. Có thể tính thể tích lưu của chất không bị lưu giữ từ thời gian lưu của chất không bị lưu giữ (t₀) và tốc độ dòng F (ml/min) theo công thức sau:

V₀ = t₀* F

Hằng số phân bố (K₀)

Trong phương pháp sắc ký rây phân tử, đặc tính rửa giải của một chất có thể được biểu thị dưới dạng hằng số phân bố (còn gọi là hệ số phân bố) K₀ và được tính theo công thức:

K₀ = (t_R – t₀)/(t_t – t₀)

Thừa số chậm (R_f)

Thừa số chậm R_f, hay còn gọi là hệ số di chuyển R_f, được dùng trong sắc ký trên mặt phẳng (sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) là tỷ số giữa khoảng cách từ điểm chấm mẫu đến tâm của vết sắc ký và khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ điểm chấm mẫu (Hình 5.3).

R_f = b/a

Trong đó:

b là quãng đường di chuyển của chất phân tích;

a là quãng đường di chuyển của tuyến dung môi.

Số đĩa lý thuyết (N)

Tùy thuộc vào kỹ thuật sử dụng, hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột) biểu thị dưới dạng số đĩa lý thuyết, có thể tính được từ những dữ liệu thu được dưới điều kiện đẳng nhiệt, đẳng dòng hoặc đẳng mật độ (isodense), theo công thức sau, trong đó các giá trị t_R và w_h có cùng đơn vị đo:

N = 5.54 * (t_R/w_h)²

Trong đó:

t_R là thời gian lưu của pic tương ứng với chất phân tích;

w_h là chiều rộng pic ở nửa chiều cao pic.

Số đĩa lý thuyết thay đổi theo chất, theo cột, nhiệt độ cột, pha động và thời gian lưu.

Thể tích lưu trú (D) (Dwell volume)

Thể tích lưu trú (còn gọi là thể tích trễ gradient) là thể tích giữa điểm mà các chất rửa giải của pha động gặp nhau và đỉnh của cột. Nó có thể được xác định bằng cách sau:

Cột: Thay cột sắc ký bằng một ống mao quản thích hợp (ví dụ ống 1m X 0,12mm).

Pha động: Pha động A: Nước cất;

Pha động B: Dung dịch aceton 0,1% (tt/tt)

Thời gian (min)	Pha động A (%, tt/tt)	Pha động B (%, tt/tt)
0 – 20	100 => 0	0 => 100
20 – 30	0	100

 

Tốc độ dòng: Đặt tốc độ đòng sao cho có áp suất ngược thích hợp (back-pressure) (ví dụ 2ml/min).

Phát hiện: Quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 265nm. Xác định thời điểm (t_0.5) tính bằng phút khi độ hấp thụ tăng lên đạt 50% (Hình 5.4).

D = t_D * F

Trong đó: t_D = t_0.5* 0.5t_G (tính bằng phút);

t_G là thời gian gradient đã xác định trước (= 20 min); F là tốc độ dòng (tính bằng ml/min).

Hệ số đối xứng (A_S)

Hệ số đối xứng của một pic (Hình 5.5) được tính theo công thức sau:

A_S = w_0.05 /(2 * d)

Trong đó:

w_0.05 là chiều rộng cùa pic ở 1/20 chiều cao của pic;

d là khoảng cách tính từ đường thẳng đứng đi qua đỉnh pic đến cạnh phía trước của pic ở 1/20 chiều cao của pic.

Khi A_S = 1,0 thì pic hoàn toàn đôi xứng. Khi A_S > 1,0 thì pic bị kéo đuôi. Khi A_S < 1,0 thì pic bị doãng về phía trước.

Độ phân giải (R_S)

Độ phân giải (R_S) giữa hai pic của hai chất (Hình 5.5) được tính theo công thức sau:

R_S=1,18 * (t_R2 – t_R1)/(w_h1 + w_h2)

Trong đó:

t_R2> t_R1

t_R1, t_R2 là thời gian lưu của các pic tương ứng;

w_h1, w_h2 là chiều rộng pic ở nửa chiều cao pic.

Trong phương pháp định lượng bằng sắc ký trên mặt phẳng dùng phép đo mật độ. khoảng cách di chuyển được dùng thay cho thời gian lưu và độ phân giải giữa các pic của 2 chất có thể được tính theo công thức sau:

R_S=1,18 * a * (R_F2 – R_F1)/(w_h1 + w_h2)

Trong đó:

R_F1, R_F2 là thời gian lưu của các pic tương ứng;

w_h1, w_h2 là chiều rộng pic ở nửa chiều cao pic.

a là khoảng cách di chuyển của tuyến dung môi

Tỷ số đỉnh – hõm (p/v)

Tỷ sổ đỉnh – hõm (p/v) có thể được dùng như một thông số về tính phù hợp của hệ thống trong phép thử các tạp chất liên quan khi hai pic không được tách đến đường nền (Hình 5.6)

p/v = H_p/H_v

Trong đó:

H_p là chiều cao của đỉnh pic nhỏ so với đường nền ngoại suy;

H_v là chiều cao của đáy hõm tách hai pic lớn và nhò so với đường nền ngoại suy

Độ lưu giữ tỷ đối (r)

Độ lưu giữ tỷ đổi (r) có thể ước lượng theo công thức sau:

R = (t_Ri – t_M)/(t_Rst – t_M)

Trong đỏ:

t_Ri; là thời gian lưu của pic chất được quan tâm;

t_Rst là thời gian lưu của pic chất đối chiếu (thường là pic tương ứng với chất cần thử);

t_M là thời gian chết.

Độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chỉnh (r_G) được tính theo công thức:

r_G = t_Ri/t_Rst

Trừ khi có hướng dẫn khác, các giá trị độ lưu giữ tỷ đối cho trong các chuyên luận là độ lưu giữ tỷ đối chưa hiệu chỉnh. Trong sắc ký trên mặt phẳng, các thừa số chậm R_Fst và R_F được dùng thay cho các thời gian lưu t_Rst, và t_Ri

Tỷ số tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Nhiễu có ảnh hường đến độ chụm của phép định lượng. Tỷ số tín hiệu trên nhiễu được tính theo công thức:

S/N = 2H/h

Trong đó:

H là chiều cao pic (Hình 5.7) tương ứng với chất được khảo sát trên sắc đồ thu được với dung dịch chất đối chiếu đã định; chiều cao này đo từ đỉnh pic đến đường nên ngoại suy được xác định trên một khoảng bằng ít nhất 5 lần chiều rộng của pic ở nửa chiều cao pic;

h là khoảng dao động của nhiễu đường nền trên sắc đồ thu được sau khi tiêm một mẫu trắng: khoảng dao động này được xác định trên một quãng đường bằng ít nhất 5 lần chiều rộng của pic ở nữa chiều cao pic trên sắc đồ thu được khi tiêm dung dịch chất đối chiếu đã định và nếu có thể thì quãng đường này phân bố đều hai bên vị trí của pic của chất khảo sát.

Độ lặp lại

Độ lặp lại của đáp ứng được biểu thị dưới dạng phần trăm độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của một dãy kết quả của ít nhất 3 lần tiêm hoặc nạp liên tiếp dung dịch chất đối chiếu và được tính theo công thức:

RSD(%) = 100/y * sqrt(Σ(y_i – ӯ)²/(n-1))

Trong đỏ:

y_i là các giá trị cá thể dưới dạng diện tích pic, hav chiều cao pic, hoặc tỷ số các diện tích trong phương pháp nội chuẩn;

ӯ là trung bình của các giá trị cá thể;

n là số các giá trị cá thể.

Tính phù hợp của hệ thống

Các bộ phận khác nhau của thiết bị sắc ký cần phải được kiểm tra hiệu chỉnh để có thể đạt được hiệu năng theo yêu cầu khi tiến hành phép thử hay định lượng.

Các phép thử tính phù hợp của hệ thống là phần không thể thiếu của một phưong pháp và được dùng để đàm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp. Hiệu lực biểu kiến, thừa số lưu giữ (hệ số phân bố khối lượng), độ phân giải, độ lưu giừ tỷ đối và hệ số đối xứng là những thông số thường được dùng để đánh giá hiệu năng của cột. Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến đặc tính sắc ký bao gồm:

Thành phần, nồng độ ion, nhiệt độ và pH biểu kiến cùa pha động;

Tốc độ dòng, kích thước cột, nhiệt độ cột và áp suất;

Các đặc tính của pha tĩnh hao gồm loại chất mang, độ xốp (cỡ lồ), cỡ hạt, kiểu các hạt. diện tích bề mặt riêng;

Pha đào và các pha tĩnh có biển đổi bề mặt khác như biến đổi hoá học (được biểu thị bởi end-capping, carbon loading v.v…

Các yêu cầu sau đây và các yêu cầu bổ sung trong chuyên luận cụ thể phải được đáp ứng, trừ khi có chỉ dẫn khác:

Trong phép thử các tạp chất liên quan hay định lượng, hệ số đối xứng của pic chính trên sắc ký đồ thu được từ dung dịch đối chiếu phải trong khoảng từ 0,8 đến 1,5, trừ khi có chỉ dẫn khác;

Trong phép định lượng hoạt chất mà giá trị xác định là 100% chất tinh khiết, độ lệch chuẩn tổi đa được phép [RSD(%)_max] cho các lần tiêm lặp lại của dung dịch đối chiếu được tính theo công thức sau:

RSD(%)_max = K * B * sqrt(n)/t_{90%, n -1}

Trong đó:

K là một hằng số (-0.349) thu được từ biểu thức

K = 0.6/sqrt(2) * t_90%,5/sqrt(6)

Mà 0.6/sqrt(2) biểu thị độ lệch chuẩn tương đối yêu cầu cho 6 lần tiêm với B = 1.0;

B là giới hạn trên được cho trong chuyên luận riêng trừ đi 100%;

n là số lần tiêm lặp lại dung dịch đối chiếu (3 ≤ n ≤ 6);

t_90%,n-1 là giá trị t-Student ở mức xác xuất 90% (hai phía) với bậc tự do n – 1.

Nếu không có chỉ dẫn gì khác, độ lệch chuẩn tương đối được phép tối đa không được vượt quá giá trị tương ứng ghi trong Bảng 5.1. Yêu cầu này không áp dụng cho phép thử các tạp chất liên quan

Bảng 5.1 Yêu cầu về độ lặp lại

Số lần tiêm lặp lại
	3	4	5	6
B(%)	Độ lệch chuẩn tương đối được phép tối đa
2.0	0.41	0.59	0.73	0.85
2.5	0.52	0.74	0.92	1.06
3.0	0.62	0.89	1.10	1.27

 

Trong phép thử các tạp chất liên quan, giới hạn định lượng (tương ứng với tỷ số tín hiệu trên nhiễu bằng 10) phải bằng hoặc nhỏ hơn giới hạn được bỏ qua.

Yêu cầu về tính phù họp của hệ thống là đòi hỏi cho quá trình tiến hành sắc ký. Tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như tần suất sử dụng và kinh nghiệm với hệ thống sắc ký, người phân tích sẽ lựa chọn một quy trình kiểm chứng thích hợp về tính phù hợp này.

Điều chỉnh các điều kiện sắc ký

Mức độ điều chỉnh các thông số khác nhau để thỏa mãn tính phù hợp của hệ thống sắc ký mà không làm thay đổi căn bản phương pháp được liệt kê dưới đây. Việc điều chỉnh các điều kiện rửa giải gradient thì khắt khe hơn so với rửa giải đẳng dòng vì nó có thể dẫn tới sự chuyển dịch các pic đến một bước khác của quá trình gradient. Điểu này dần đến việc xác định không đúng vị trí các pic làm che lấp pic hoặc làm chuyển dịch pic tới mức chất phân tích được rửa giải ra sau thời gian đã định. Những thay đổi khác với những điểm đã được qui định đòi hòi phải thẩm định lại phương pháp. Những điều kiện sắc ký được mô tả đều đã được thẩm định khi biên soạn xây dựng chuyên luận.

Các phép thử tính thích hợp cùa hệ thống được đưa vào để đảm bảo yêu cầu chia tách cho phép thử hay phép định lượng đạt chất lượng mong muốn. Tuy nhiên, vì pha tĩnh chỉ được mô tả một cách chung chung và trên thị trường lại có nhiều loại pha tĩnh có những đặc tính sắc ký khác nhau, nên có thể cần điều chỉnh một số điều kiện sắc ký để đạt yêu cầu của tính phù hợp hệ thống. Đặc biệt trong phương pháp sắc ký pha đảo, việc thay đổi các thông số sắc ký không phải lúc nào cũng cho kết quả thỏa đáng. Trong trường hợp này, có thể phải thay cột khác cùng loại, ví dụ cột siiica gel gắn với nhóm octadecylsilyl (C₁₈) khác mà có thể cho kết quả mong muốn. Với các thông số quan trọng, việc điều chỉnh được xác định rõ ràng trong chuyên luận để đảm bảo tính phù hợp của hệ thống.

Sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy

Thành phần của pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30% nồng độ tương đối hay ± 2% nồng độ tuyệt đối tùy theo khoảng giá trị nào lớn hơn. Ví dụ với dung môi thành phần nhỏ là 10% của pha động thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là nồng độ trong khoảng 7% đến 13% trong khi thay đổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa là nồng độ trong khoảng 8% đến 12%; như vậy, khoảng theo nồng độ tương đối lớn hơn: nếu thành phần dung môi nhỏ là 5% thì thay đổi 30% tương đối nghĩa là trong khoảng 3,5% đến 6,5% và thay đổi 2% nồng độ tuyệt đối nghĩa là trong khoảng 3% đến 7%, trong trường hợp này khoảng theo nồng độ tuyệt đối lớn hơn. Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối.

pH của thành phần nước trong pha động được thay đổi ± 0,2 đơn vị pH trừ khi có chi dẫn khác trong chuyên luận, hoặc thay đổi = 1,0 đơn vị pH khi nghiên cứu các chất không ion hóa.

Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động được thaỵ đổi +10%.

Thể tích mẫu chấm sắc ký điều chỉnh trong khoảng 10% đến 20% của thể tích quy định nếu sử dụng bản mỏng cỡ hạt nhỏ (2µm đến 10 µm).

Khoảng dịch chuyển của tuyến dung môi không được dưới 50mm và với bản mỏng hiệu nãng cao thì không được dưới 30mm.

Sắc kỷ lỏng rữa giải đẳng dòng

Thành phần pha động: Lượng thành phần dung môi nhỏ có thể điều chỉnh ± 30% nồng độ tương đối hay ± 2% nồng độ tuyệt đối tùy theo khoảng giá trị nào lớn hơn (xem ví dụ ở trên). Không thành phần dung môi nào được thay đổi lớn hơn 10% nồng độ tuyệt đối.

pH của thành phần nước trong pha động: Chỉ điều chỉnh thay đổi ± 0,2 đơn vị pH trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận, hoặc thay đổi ± 1,0 đơn vị pH khi nghiên cứu các chất không ion hóa.

Nồng độ muối trong thành phần đệm cùa pha động được thay đổi ± 10%.

Tốc. độ dòng: ± 50%; có thể chấp nhận một sự điều chỉnh lớn hơn khi thay đổi kích thước cột (xem công thức ở dưới).

Các thông số cột:

Pha tĩnh:

Không thay đồi bản chất của nhóm thế trong pha tĩnh (ví dụ không thay C₁₈ bằng C₈);

Kích thước hạt: Cho phép gìảm tối đa 50%; không được phép tăng.

Kích thước cột:

Chiều dài: ± 70%;

Đường kính trong: ± 25%.

Khi kích thước cột thay đổi, tốc độ dòng cỏ thổ phải điều chỉnh theo công thức sau:

F₂ = F₁ * l₂*d₂²/(l₁ * d₁²)

Trong đó:

F₁ là tốc độ dòng được chỉ ra trong chuyên luận, tính theo ml/min;

F₂ là tốc độ dòng hiệu chỉnh, tính theo ml/min;

l₁ là chiều dài cột ghi trong chuyên luận, tính bàng mm;

l₂ là chiều dài cột được sử dụng, tỉnh bằng mm;

d₁ là đường kính trong của cột ghi trong chuyên luận, tính bằng mm;

d₂ là đường kính trong cùa cột được sử dụng, tính bằng mm.

Nhiệt độ: Được điều chình ± 10°C khi có quy định nhiệt độ tiến hành sắc ký, trừ khi có chỉ dẫn khác.

Bước sóng của detectorphát hiện: Không được điều chỉnh.

Thể tích tiêm: Có thể giảm đi miễn là khả năng phát hiện và độ lặp lại của pic cần xác định thỏa mãn yêu cầu; không cho phép tăng thể tích tiêm.

Sắc ký lỏng rửa giải gradient

Việc điều chỉnh các điều kiện cho hệ thống sắc ký rửa giải gradient đòi hỏi cần cẩn thận hơn so với hệ thống sắc ký đẳng dòng.

Thành phần của pha dộng dùng rửa giải gradient: Những điều chỉnh nhỏ về thành phần của pha động và chương trình dung môi có thể được chấp nhận, miễn là:

Các yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống được thỏa mãn;

Các pic chính được rửa giải trong vòng ±15% của thời gian lưu quy định;

Thành phần cuối cùng của pha động không yếu hơn về lực rửa giải so với thành phần quy định.

Khi không thể đạt được thỏa mãn các yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống thì nên xem xét về thể tích lưu trú (dwell volume) hoặc thay đổi cột tách.

Thể tích lưu trú (Dwell volume): cấu hình của thiết bị dùng có thể làm thay đổi đáng kể độ phân giải, thời gian lưu và thời gian lưu tỷ đối được quy định; đó là do thể tích lưu trú quá lớn. Các chuyên luận thường đưa vào một giai đoạn đẳng dòng trước khi bắt đầu chương trình gradient để làm thích ứng với các thời điểm gradient; điều này giúp xem xót sự khác nhau giữa thể tích lưu trú của hệ thống thiết bị được sử dụng để phát triển phương pháp và hệ thống đang được sử dụng. Người sử dụng có trách nhiệm điều chỉnh khoảng thời gian của giai đoạn đẳng dòng cho phù hợp với thiết bị được sử dụng. Nếu thể tích lưu trú được dùng khi xây dựng chuyên luận được chỉ ra trong chuyên luận, các thời điểm (t min) ghi trong bảng chương trình dung môi có thể được thay thế bằng các thời điểm điều chỉnh (t_c min) và được tính bằng công thức sau:

t_c = t – (D – D₀)/F

Trong đó:

D là thể tích lưu trú, tính bằng ml;

D₀ là thể tích lưu trú khi phát triển phương pháp, tính bàng ml;

F là tốc độ dòng tính bằng ml/min.

Giai đoạn đẳng dòng bổ sung cho mục đích trên đây có thể bỏ qua nếu các số liệu thẩm định để áp dụng phương pháp không có giai đoạn này.

pH của thành phần nước trong pha động không được phép điều chỉnh.

Nồng độ muối trong thành phần đệm của pha động cũng không được phép điều chỉnh.

Tốc độ dòng: Có thể điều chinh tốc dộ dòng khi kích thước cột tách thay đổi (xem công thức ở dưới).

Các thông số về cột:

Pha tĩnh: Không thay đổi bản chất của nhóm thế trong pha tĩnh (ví dụ không thay C₁₈ bằng C₈);

Kích thước tiểu phân không được thay đổi.

Kích thước cột:

Chiều dài: ±70%: Đường kính trong: ±25%. Khi kích thước cột tách thay đổi, tốc độ dòng có thể phải điều chỉnh dựa theo công thức sau:

F₂ = F₁ * l₂*d₂²/(l₁ * d₁²)

Trong đó:

F₁ là tốc độ dòng được chỉ ra trong chuyên luận, tính theo ml/min;

F₂ là tốc độ dòng hiệu chỉnh, tính theo ml/min;

l₁ là chiều dài cột ghi trong chuyên luận, tính bàng mm;

l₂ là chiều dài cột được sử dụng, tỉnh bằng mm;

d₁ là đường kính trong của cột ghi trong chuyên luận, tính bằng mm;

d₂ là đường kính trong cùa cột được sử dụng, tính bằng mm.

Nhiệt độ: Được điều chình ± 5°C khi có quy định nhiệt độ tiến hành sắc ký, trừ khi có chỉ dẫn khác.

Bước sóng của detectorphát hiện: Không được điều chỉnh.

Thể tích tiêm: Có thể giảm đi miễn là khả năng phát hiện và độ lặp lại của pic cần xác định thỏa mãn yêu cầu; không cho phép tăng thể tích tiêm.

Sắc ký khí

Các thông số về cột:

Pha tĩnh:

Kích thước tiểu phân: Có thể giảm tối đa 50%; không được phép tăng lên (cột nhồi);

Bề dày lớp phim: Cho phép thay đổi từ -50% đến +100% (cột mao quản).

Kích thước cột:

Chiều dài: ± 70%;

Đường kính trong: ± 50%.

Tốc độ dòng: ± 50%.

Nhiệt dộ: ± 10%.

Thể tích tiêm và thể tích chia dòng: Có thể được điều chỉnh, miễn là khả năng phát hiện và độ lặp lại là thỏa mãn yêu cầu.

Sắc ký lỏng siêu tới hạn

Thành phần pha động: Đối với cột nhồi, lượng hợp phần dung môi nhỏ có thể được điều chỉnh ± 30% tương đối hay ± 2% tuyệt đối, tùy theo khoảng giá trị nào lớn hơn; không cho phép thay đổi đối với hệ thống cột mao quản.

Bước sóng phát hiện của detector không được thay đổi.

Các thông số về cột:

Pha tĩnh: Kích thước tiểu phân: Có thể giàm tối đa 50%; không được phép tăng lên (cột nhồi).

Kích thước cột:

Chiều dài: ± 70%;

Đường kính trong: ± 25% cho cột nhồi và ± 50% cho cột mao quản.

Tốc độ dòng: ± 50%.

Nhiệt độ: Cho phép ± 5°C khi nhiệt độ vận hành sắc ký được quy định trong chuyên luận.

Thể tích tiêm: Có thể được điều chỉnh, miễn là khả năng phát hiện và độ lặp lại là thỏa mãn yêu cầu, không được phép tăng lên.

Định lượng

Các pic của dung môi và thuốc thử hoặc xuất hiện từ pha động hay nền mẫu thì bỏ qua trong quá trình định lượng.

Độ nhạy của detector: Độ nhạy của detector là tín hiệu đầu ra tính trên một đơn vị nồng độ hay một đơn vị khỏi lượng chất có trong pha động đi vào detector. Hệ số đáp ứng tương đối của detetor, thường được gọi là hệ số đáp ứng, biểu thị độ nhạy của một detector đối với một chất chuẩn. Hệ số hiệu chỉnh là nghịch đảo của hệ số đáp ứng.

Phương pháp chuẩn ngoại: Nồng độ các thành phần cần phân tích được xác định bằng cách so sánh (các) đáp ứng pic của dung dịch thử đối với đáp ứng pic của dung dịch chất đối chiếu.

Phương pháp chuẩn nội: Chất chuẩn nội phải là một chất có thể tách khỏi chất khảo sát. Thêm cùng lượng chuẩn nội vào dung dịch thử và dung dịch chất đối chiếu. Chất chuẩn nội không được có phản ứng với chất khảo sát, phải bền và không chứa tạp có thời gian lưu tương tự thời gian lưu chất khảo sát. Nồng độ chất khảo sát được xác định dựa vào việc so sánh tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa chất khảo sát và chuẩn nội trong dung dịch thử với tỷ số diện tích pic (hay chiều cao pic) giữa chất khảo sát và chuẩn nội trong dung dịch chất đối chiếu.

Phương pháp chuẩn hóa: Còn gọi là quy trình chuẩn hóa. Hàm lượng phần trăm của một hay nhiều thành phần trong mẫu thử được tính bằng cách xác định diện tích một pic hay nhiều pic dưới dạng phần trăm của tổng diện tích tất cả các pic trừ các pic của dung môi hay thuốc thử và các pic ở mức hay dưới mức có thể bỏ qua.

Phương pháp đường chuẩn: Còn gọi là quy trình hiệu chuẩn. Xác định mối quan hệ giữa tín hiệu đo được hay đánh giá được (y) và lượng (nồng độ, khối lượng, v.v…) của chất (x) rồi tính hàm hiệu chuẩn (phương trình đường chuẩn). Tính kết quả phân tích từ tín hiệu của chất phân tích (được đo hay được đánh giá) theo phưong pháp hàm số ngược.

Trong các phép thử tạp chất liên quan, người ta dùng hoặc phương pháp chuẩn ngoại với một dung dịch thử được pha loãng để so sánh, hoặc dùng phương pháp chuẩn hóa, khi hệ số đáp ứng nằm ngoài khoảng 0,8 đến 1,2, thì phải áp dụng những hệ số hiệu chỉnh được chỉ ra trong chuyên luận. Khi trong chuyên luận có quy định phép thử các tạp chất liên quan là tổng các tạp chất hay khi phải định lượng một tạp chất thì điều quan trọng là phải chọn một ngưỡng thích hợp và các điều kiện thích hợp cho việc lấy tích phân các diện tích pic. Trong các phép thử như vậy thì ngưỡng bỏ qua (nghĩa là các diện tích pic bằng hoặc dưới ngưỡng này không phải tính đến) thường là 0,05%. Như vậy, ngưỡng đặt cho hệ thống thu thập dữ liệu ít nhất phải là nửa ngưỡng bỏ qua. Việc lấy tích phân các diện tích pic của các tạp không được tách hoàn toàn khỏi pic chính nên được thực hiện theo phương pháp ngoại suy từ hõm tới hõm (vạch tiếp tuyến).